Produzione di acido muconico da glucosio e xilosio in Pseudomonas putida attraverso l'evoluzione e l'ingegneria metabolica

Nature Communications volume 13, numero articolo: 4925 (2022) Citare questo articolo

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L’acido muconico è una molecola bioprivilegiata che può essere convertita in sostanze chimiche sostitutive dirette per i prodotti petrolchimici storici e bioprodotti con prestazioni vantaggiose. In questo studio, Pseudomonas putida KT2440 è progettato per convertire glucosio e xilosio, i carboidrati primari negli idrolizzati lignocellulosici, in acido muconico utilizzando una strategia guidata da modello per massimizzare la resa teorica. Utilizzando l'evoluzione adattiva del laboratorio (ALE) e l'ingegneria metabolica in un ceppo progettato per esprimere la via della D-xilosio isomerasi, dimostriamo che le mutazioni nel trasportatore eterologo D-xilosio:H+ (XylE), aumentano l'espressione di un importante trasportatore della superfamiglia facilitatore (PP_2569 ) e la sovraespressione di aroB che codifica per la sintasi nativa 3-deidrochinato, consentono un'efficiente produzione di acido muconico da glucosio e xilosio simultaneamente. Utilizzando il ceppo progettato razionalmente, produciamo 33,7 g L−1 di muconato a 0,18 g L−1 h−1 e una resa molare del 46% (92% della resa teorica massima). Questa strategia ingegneristica è promettente per la produzione di altri composti derivati dalla via shikimate da zuccheri lignocellulosici.

Lo sviluppo di processi economici per la produzione di biocarburanti e prodotti biochimici dalla lignocellulosa sarà fondamentale per contribuire a ridurre le emissioni di gas serra di origine antropica associate al consumo di combustibili fossili1,2. Tra le varie aree dello spazio metabolico esplorate per la produzione biochimica, le molecole delle vie cataboliche aromatiche microbiche mostrano una sostanziale diversità chimica3,4. Da notare che l'acido cis,cis-muconico (di seguito muconato) è una popolare piattaforma chimica della via catabolica del catecolo che può essere prodotta da composti aromatici derivati dalla lignina, carboidrati e composti aromatici derivati dalla plastica di scarto5,6,7,8,9 ,10,11,12. Il muconato è una molecola bioprivilegiata13 che può essere convertita in sostanze chimiche sostitutive dirette, come acido adipico e acido tereftalico5,14,15, o convertita in bioprodotti con prestazioni vantaggiose16,17,18,19,20,21,22,23,24 .

La produzione di muconato dai carboidrati si basa sulla via shikimate per la biosintesi degli aminoacidi aromatici ed è stata dimostrata per la prima volta nell'Escherichia coli ricombinante5. L'eritrosio-4-fosfato (E4P) e il fosfoenolpiruvato (PEP) vengono condensati per formare 3-desossi-d-arabinoeptulosonato 7-fosfato (DAHP), che viene ulteriormente convertito in 3-deidroshikimato (3-DHS), un intermedio chiave nel percorso shikimate. Dal 3-DHS sono stati segnalati almeno cinque percorsi per la biosintesi dei muconati25,26,27,28,29,30. Tra questi percorsi, uno procede attraverso il protocatechuato intermedio (PCA) tramite una 3-DHS deidratasi (asbF) e si traduce in una resa teorica massima più elevata rispetto agli altri, che procedono attraverso lo shikimato tramite una shikimato deidrogenasi (aroE) (Fig. 1a )29.

uno schema della strategia complessiva di ingegneria metabolica. Per utilizzare lo xilosio, xylE, d-xilosio isomerasi (xylA), xilulochinasi (xylB), transaldolasi (tal) e transketolasi (tkt) da E. coli sono stati espressi eterologamente. E4P e PEP sono stati condensati per formare DAHP tramite una DAHP sintasi resistente al feedback (aroGD146N)70. Per convertire il DAHP in muconato (MA), i geni che codificano per una 3-DHS deidratasi (asbF) del Bacillus cereus e una PCA decarbossilasi (aroY) e la sua corrispondente proteina generatrice di cofattori (ecdB), entrambi provenienti da Enterobacter cloacae, sono stati analizzati eterologamente espresso. aroB e catecol 1,2-diossigenasi (catA) erano sovraespressi3,32. Un corismato piruvato-liasi ingegnerizzato da E. coli (ubiC-C22)40 è stato sovraespresso per convertire il corismato (CSA) in 4-idrossibenzoato (4HB), che può essere convertito in PCA e MA. I geni cancellati sono mostrati in rosso.La glucosio deidrogenasi (gcd) è stata eliminata per prevenire la formazione di xilonato o gluconato. Le isomerasi del glucosio-6-fosfato pgi-1 e pgi-2 erano state precedentemente eliminate3,32, ma pgi-1 è stata ripristinata in questo studio. Le piruvato chinasi pykA e pykF sono state eliminate ciascuna per ridurre la competizione per il PEP. Per accumulare MA, pcaHG e catBC sono stati eliminati per prevenire rispettivamente l'apertura dell'anello di PCA e il catabolismo di MA. P fosfato, 2-KGn 2-chetogluconato, 2-KG-6-P 2-chetogluconato-6-P, G6P glucosio-6-P, 6PG 6-fosfogluconato, KDPG 2-cheto-3-deossi-6-fosfogluconato, G3P gliceraldeide-3-P, FBP fruttosio-1,6-P2, F6P fruttosio-6-P, S7P sedoeptulosio-7-P, R5P ribosio-5-P, Ri5P ribulosio-5-P, 3PG 3-fosfoglicerato, CAT catecolo, SA shikimato, S3P shikimato-3-fosfato, ICIT isocitrato, CIT citrato, AKG alfa-chetoglutarato, SUCC succinato, FUM fumarato, MAL malato, GLX gliossilato, OAA ossalacetato, AcCoA acetil-coenzima A. b Modellazione metabolica del massimo rese teoriche molari muconate e carbonio con o senza pgi-1. Le linee blu rappresentano il percorso asbF, le linee rosse rappresentano il percorso aroE, le linee continue rappresentano la percentuale di resa molare e le linee tratteggiate rappresentano la percentuale di resa di carbonio. Le aree grigie rappresentano la percentuale molare di xilosio consumata dal 33 al 40% (con il resto del glucosio), imitando la composizione degli idrolizzati di stocchi di mais. c Coltivazioni in pallone agitato del ceppo QP328 su glucosio e xilosio. La resa molare % è stata calcolata come [muconato mM/mM (glucosio + xilosio) × 100] e la resa molare % è stata calcolata come [muconato mM × 6/mM (glucosio × 6 + xilosio × 5) × 100]. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard dei triplicati biologici. I dati di origine vengono forniti come file di dati di origine.

For shake flask and growth curve experiments, seed cultures were inoculated from glycerol stocks into 14-mL round bottom Falcon® tubes containing 5 mL of LB Miller medium and incubated overnight at 30 °C and 225 rpm. Overnight cultures were then inoculated into a 125-mL baffled shake flask containing 10 mL LB medium to an initial OD600 of 0.2. These second seed cultures were cultivated at 30 °C at 225 rpm for 4 h to reach an OD600 of ~2. The second seed cultures were washed twice with M9 salts (6.78 g L−1 Na2HPO4, 3 g L−1 KH2PO4, 0.5 g L−1 NaCl, 1 g L−1 NH4Cl) and then inoculated into a 125-mL baffled shake flask containing 25 mL modified M9 minimal medium (6.78 g L−1 Na2HPO4, 3 g L−1 KH2PO4, 0.5 g L−1 NaCl, 1 g L−1 NH4Cl, 2 mM MgSO4, 100 µM CaCl2, 18 µM FeSO4) supplemented with either 30 mM xylose, 30 mM glucose, or mixture of 30 mM glucose and 15 mM xylose, to an initial OD600 of 0.1. The molar ratio of glucose and xylose in mixed substrates is 2:1, which is the ratio typical of corn stover hydrolysates10% v/v) during fermentation without hydrolysate purification or concentration. Energy Environ. Sci. 9, 1237–1245 (2016)." href="/articles/s41467-022-32296-y#ref-CR56" id="ref-link-section-d4408857e3149"56. All growth curves were characterized on Bioscreen C Pro analyzers (Growth Curves US) using 300-µL cultures inoculated as described for the shake flasks above. Shake flasks and plate reader data were plotted and analyzed using GraphPad Prism version 8.4.2. Absolute growth rate (μA) and growth lag (λ) were calculated based on Gompertz equation using default settings of the FittR tool deposited in GitHub (https://github.com/scott-saunders/growth_curve_fitting)57. In some cases, death phase was removed from the growth curve to fit the model./p>

Cells were inoculated in 0.5 L bioreactors (BioStat-Q Plus, Sartorius Stedim Biotech) at an initial OD600 of 0.2. The batch phase consisted of growth on 300 mL of modified M9 with 10.6 g L−1 glucose and 4.4 g L−1 xylose, which mimics the sugar ratio in sugar hydrolysates from corn stover10% v/v) during fermentation without hydrolysate purification or concentration. Energy Environ. Sci. 9, 1237–1245 (2016)." href="/articles/s41467-022-32296-y#ref-CR56" id="ref-link-section-d4408857e3452"56. The fed-batch phase was initiated when the sugar concentration was approximately 7 g L−1, at which point sugars were fed to maintain sugar concentrations between ~2–10 g L−1 by manually modifying feeding rates. The feeding solution contained 353 g L−1 glucose and 147 g L−1 of xylose, and its pH was adjusted to pH 7 with NaOH. The bioreactors were controlled at pH 7 by the addition of 4 N NH4OH, at 30 °C, and air was sparged at 1 vvm. The initial agitation speed in the batch phase was 350 rpm. When the dissolved oxygen (DO) reached a value of 30%, it was automatically controlled at that level by automatic agitation adjustments. Samples were taken periodically to evaluate bacterial growth and to analyze sugar concentrations and muconate./p>10% v/v) during fermentation without hydrolysate purification or concentration. Energy Environ. Sci. 9, 1237–1245 (2016)./p>